Tratamentos: Diagnóstico Genético Pré Implantacional

O PGD é um procedimento tecnicamente desafiador, que exige um bom entendimento de embriologia e biologia molecular. Durante a FIV, os oócitos e os pré-embriões em estágios precoces de clivagem são facilmente acessíveis, permitindo uma ou uma série de biópsias dessas células. No entanto, a quantidade de material genético segura, permanece ainda limitada para a confirmação de diagnósticos.

Os protocolos atuais de transferência exigem uma sincronização do estágio embrionário com a receptividade uterina. Há apenas uma pequena janela de oportunidade para completar a tarefa de diagnóstico genético pré-implantação. Apesar dessas barreiras, o PGD vem se tornando, parte integral de muitos programas de FIV.

As três maiores aplicações do PGD são:

1. A enumeração da composição cromossômica pode ser conseguida com a FISH (fluorescent "in situ" hybridization), permitindo a determinação da ploidia exata do pré-embrião concomitante ao diagnóstico de certas aneuploidias mais comuns. Em mulheres com idade materna avançada, isso reduz ou até elimina o risco de dar à luz a uma criança com trissomias, por exemplo, a trissomia do 21 (síndrome de Down). A FISH pode ser usada também para detectar anomalias cromossômicas estruturais.

2. Podem ser detectados pela PCR (Polymerase Chain Reaction) e CGH (Comparative Genomic Hybridization), defeitos genéticos envolvendo um único gene, como a fibrose cística, a anemia falciforme e outras doenças comuns com alterações genéticas.

3. O sexo de um pré-embrião pode ser determinado através da FISH ou por análises de sequências cromossômicas, usando a técnica de PCR. Dessa forma, doenças ligadas ao sexo podem ser determinadas e evitadas.

Vale ressaltar que, seguindo as normas do Conselho Federal de Medicina, a técnica não pode ser realizada somente para a determinação do sexo do embrião, exceto em casos de busca pelo diagnóstico de doenças ligadas ao sexo.

O primeiro aspecto crítico do PGD é a obtenção de material genético suficientemente informativo sem danificar o potencial de desenvolvimento do pré-embrião. Esses esforços incluem biópsias como:

Biópsia do primeiro corpúsculo polar (Diagnóstico genético pré-concepcional)

Biópsia do segundo corpúsculo polar

Biópsia de blastômeros em estágio de clivagem (embriões com 6 a 8 células)

Biópsia de células do trofoectoderma (blastocisto)

Teoricamente, a biópsia de células do trofoectoderma representa o procedimento com melhor potencial para recuperar quantidade suficiente de células para análise genética, comparado a outros métodos.

No entanto, a biópsia de blastômeros continua sendo o método preferido na maioria das clínicas. Os detalhes técnicos específicos para a biópsia tendem a ser desenvolvidos de acordo com as preferências pessoais e experiência do embriologista.

Embora possa ser feita a biópsia diretamente do blastômero, o método mais comum e confiável, é com a solução de ácido de Tyrode (AT) ou laser para romper a ZP.

Técnicas laboratoriais para PGD

O material genético para análise está limitado a uma ou duas estruturas (corpúsculos polares, um ou dois blastômeros). Além disso, a biópsia de corpúsculo polar não é aplicável se a doença em questão for transmitida pelo homem. A análise cromossômica direta é realizada somente no primeiro ou segundo corpúsculos polares, porque nos estágios mais precoces de clivagem (6 a 10 células), raramente se obtêm cromossomas em metáfase.

A técnica FISH foi desenvolvida somente na última década e permite a determinação do número de cromossomas específicos, através da contagem de sinais específicos nos núcleos em interfase. Essa técnica é muito sensível e assertiva. Ela pode fazer o diagnóstico de aneuploidias e translocações balanceadas.

Atualmente podemos analisar por FISH, até oito pares de cromossomos. São eles:

Cromossomos: 13 (síndrome de Patau); 14; 15; 16; 18 (síndrome de Edwards); 21 (síndrome de Down); 22; e Cromossomo sexual X, Y.

A técnica da PCR revolucionou a análise do DNA. O procedimento envolve repetidas amplificações do DNA para obter cópias adequadas para análise. O uso dessa técnica permite detectar mutações em genes, corpúsculos polares ou blastômeros.

O DNA amplificado pode ser submetido a análise de mutações através de vários métodos, cuja seleção é determinada pelas características da mutação investigada.

Embora a lista de doenças passíveis de investigação pela PCR-PGD esteja crescendo muito rápido, ainda existem vários problemas inerentes à técnica. O controle de contaminação de DNA é crucial. Mesmo as quantidades diminutas de DNA estranho contaminante, gera efeitos adversos sobre todo o método, já que tal material seria amplificado com o molde original do espécime biopsiado. As técnicas necessárias para se produzir um resultado confiável devem ser rigorosamente mantidas e o laboratório de PCR deve estar em um local isolado.

Outros problemas envolvem a possibilidade de amplificação preferencial de alelos ou pior, alelo marginalizado. Tentativas recentes tiveram resultados promissores. No entanto, ainda é obscuro se a eliminação completa deles é possível.

A fibrose cística e a anemia falciforme são as duas doenças mais comumente identificadas pelo PCR.

Normalmente, 40% a 50% dos embriões em desenvolvimento conseguem alcançar esta etapa. O embrião tem um potencial de implantação maior por chegar a blastocisto.

Ela é superior a outras técnicas para diagnóstico pré-implantacional (PGD), já que permite a avaliação dos 23 pares de cromossomos. Com o CGH é possível realizar a biópsia dos embriões no quinto dia de desenvolvimento, em estágio de blastocisto. Nessa fase, o embrião apresenta mais de 100 células na sua totalidade e a retirada de algumas células para análise (cerca de cinco) é mais efetiva quando comparada à retirada de uma ou duas células no terceiro dia.

A grande dificuldade em realizar a biópsia dos embriões no quinto dia é a limitação quanto ao número de embriões que chegam a esse estágio. Normalmente 40% a 50% dos embriões em desenvolvimento conseguem alcançar essa etapa. Por chegar a blastocisto, o embrião tem um potencial de implantação maior.